Размножение грибов на примере вешенки и строфарии

Таблица. Распределение триходермы на ферме (процент проб с биотипом Тh-4)
Строение фермы Чистая зона Грязная зона
Внутри строений 16,2 35,4
Снаружи строений 1,8 14,3
Таблица
Источники инфицирования триходермой
Материал на ферме Процент проб с биотипом Тh-4
Почва, грязь 30,8
Вода (лужи) 20,0
Органические отходы 14,3
Воздух 13,8
Пыль, сажа 12,5
Исходное сырье 0
Полезная микрофлора.
Субстраты несут в себе как вредную (конкурентную или патогенную) микрофлору, так и полезную.
Микроорганизмы, обеспечивающие нормальное развитие мицелия в присутствии конкурентной
микрофлоры пока еще недостаточно изучены. Известно, что они относятся к группе термофильных бактерий рода Bacillus.
Все микроорганизмы можно разделить на группы по отношению к оптимальной температуре их
развития (табл.). Это психрофилы, мезофилы и термофилы. Вешенка и строфария относятся к
умеренным мезофилам - оптимум развития мицелия от 20 до 30оС. Большинство конкурентных
плесеней относятся к экстремальным мезофилам: оптимум развития мицелия при температуре от 30
до 45оС.
Таблица
Распределение микроорганизмов по отношению к температуре
Группа Подгруппа Температура (°С)
Психрофилы Облигатные мезо-толерантные 0-10° 10 - 20°
Мезофилы Умеренные экстремальные 20 - 30° 30 - 45°
Термофилы Термотолерантные облигатные 45 - 55° 55 - 80°
Полезная микрофлора, антагонистичная конкурентным организмам, относится к термофилам.
Наиболее изучены термофильные микроорганизмы шампиньонного компоста. Они представлены
тремя группами организмов: бактериями, актиномицетами и грибами (табл.). Оптимальный интервал
температур для их развития 45 - 55°С. Такой температурный режим устанавливают после
пастеризации компоста в фазе кондиционирования. В отличие от бактерий, которые развиваются
очень быстро (за 24 часа их количество при оптимальных условиях увеличивается в 300000 раз),
развитие актиномицетов и грибов требует нескольких суток. Процесс обработки субстрата для
культивирования вешенки обычно кратковременный (от 24 до 72 часов) и единственная возможность
микробиологической защиты субстрата реализуется за счет термофильных бактерий. При
пастеризации субстрата большая часть термофильной микрофлоры не активна, лишь некоторые виды
продолжают развиваться при температуре выше 65°С (табл.).
Таблица
Оптимальная температура для развития термофильных микроорганизмов
Группа Температура. С
Бактерии:
Bacillus subtilis
Bacillus pumilus
45-55
Актиномицеты:
Nocardia
Streptomyces
Thermoactinomyces
35-55
Грибы:
Aspergillus
Humicola
Stibella
35-55
Таблица
Время выживания термофильных грибов при различных режимах пастеризации, часы
.Температура пастеризации
Наименование
60° 65° 68°
Chaetomium thermophile 30 0 0
Humicola insoleus 30 3 0
Mucor pusillus 48 4 0,5
Stibella thermophila 2 0 0
Humicola lanuginosa 240 4 0,5
Talaromyces thermophilus 240 1 0
Селективность.
При культивировании съедобных грибов на лигноцеллюлозных субстратах конкурентные
микроорганизмы чаcто вызывают серьезное снижение урожая. В естественных условиях
ксилотрофные грибы и, в частности вешенка, растут в плотной древесине, развиваясь в ней
достаточно медленно. При интенсивном культивировании вешенки, а также строфарии используют
рыхлые субстраты, такие как опилки, измельченная кора или солома зерновых культур.
На этих субстратах мицелий вступает в конкуренцию за питание с быстро растущими плесенями.
Наиболее агрессивными конкурентами на соломе показали себя виды Trichoderma (Тr. harzianium, Тr.
hamatum и др.) и Gilmaniella humicola.
Так как полная стерилизация соломы и культивирование в стерильных условиях экономически
невыгодно при промышленном производстве грибов вешенки, возникает необходимость получения
селективного субстрата, который бы способствовал росту мицелия съедобного гриба, и в то же время
тормозил развитие конкурентных микроорганизмов. Разница в пищевых потребностях большинства
съедобных грибов и плесеней позволяет достичь необходимого уровня селективности субстратов.
Развитие плесеней зависит от наличия легкодоступных источников азотного и углеродного питания, в
то же время ксилотрофные грибы способны разрушать сложные труднодоступные лигноцеллюлозные
комплексы соломы. Обработка субстрата при высокой температуре вызывает гидролиз
растительных полисахаридов и появление свободных легкоусвояемых сахаров, которые
способствуют размножению конкурентных плесеней.
Селективный субстрат, тормозящий развитие плесеней и благоприятствующий росту мицелия,
получают при обработке умеренной температурой 65 - 70°С. Повышение температуры
обработки до 75 - 85° приводит к стимуляции развития плесеней типа Gilmaniella, Trichoderma,
Fusarium, Мuсоr (рис.), если обработка достаточно длительная.
Важна не только температура обработки субстрата, но и время обработки. Пастеризация при 65°С в
течение 6-10 часов усиливает рост Trichoderma hamatum, а в течение 12 -16 часов - рост Gilmaniella
humicola (рис.).
(пропущен текст)
Рис. Влияние температурной обработки на развитие конкурентных плесеней и мицелия вешенки,
длительность обработки – 24 часа.
1 – Pleurotus ostreatus
2 – Gilmaniella humicola
3 – Fusarium, Mucor
4 – Trichoderma hamatum
Рис. Влияние длительности пастеризации (65°С) на рост мицелия вешенки и конкурентной плесени.(в
данной публикации отсутствует)
1 – Pleurotus ostreatus
2 – Gilmaniella humicola
3 – Trichoderma hamatum
По некоторым данным ряд культур бактерий Bacillus subtilus, изолированных с соломы, ингибировал
рост плесеней, не влияя на рост мицелия вешенки.
S.Stolzer и К.Grabbe изолировали 119 культур бактерий и актиномицетов из ферментатированной
соломы и протестировали их на антагонизм к различным плесеням. Было собрано 15 активных
культур Bacillus. Культуры выращивали на жидкой среде (10 г. мелассы/л, рН - 7,0) при 25°С и затем
смешивали с соломой. Солому ферментировали при 45°С различное время и затем засевали спорами
плесеней или культурой вешенки. Бактериальные культуры разделились на 2 группы. 1-ая группа
объединяла представителей Bacillus subtilis и вызывала ингибирование роста как мицелия вешенки,
так и плесеней. 2-ая группа включала представителей вида Bacillus pumilus, которые тормозили рост
мицелия плесеней (Trichoderma , Мuсоr, Fusarium, Gilmaniella), но не влияли на развитие мицелия
вешенки.
После ферментации соломы при 45°С в течение 72 часов с наиболее активным штаммом Bacillus
pumilus субстрат был практически полностью защищен от разных видов плесеней (табл.).
Таблица.(в данной публикации отсутствует)
Влияние ферментации субстрата с термофильными бактериями В. рumilus на развитие
конкурентных плесеней (ферментация 72 часа при 45°С).
Биохимические механизмы селективности субстрата.
Первоначально считалось, что основой селективности субстрата при выращивании вешенки являются
антибиотические вещества, выделяемые в период ферментации бактериями из группы Bacillus subtilis.
Однако более поздние исследования показали, что бактерии и их выделения не оказывают
непосредственного влияния на рост мицелия плесневых грибов, следовательно, селективность
субстрата определяется другими факторами.
Получение селективного субстрата для культивирования съедобных грибов возможно потому, что
многие ксилотрофные грибы способны ферментативно разрушать лигноцеллюлозный комплекс
соломы. В то же время развитие конкурентных плесеней зависит от присутствия легкодоступных
соединений углерода и азота. Плесени рода Trichoderma, в отличие от других конкурентных плесеней,
способны разрушать ещё и целлюлозу из лигноцеллюлозного комплекса. Однако Trichoderma не
растет на термически необработанной соломе (см. рис.), что, видимо, обусловлено экранирующей
ролью лигнина, покрывающего волокна целлюлозы. При высокотемпературной обработке субстрата
лигноцеллюлозные связи частично разрушаются (делигнификация), и целлюлоза становится
доступной для ферментативного гидролиза Trichoderma hamatum.
Конкурентная плесень Gilmaniella humicola способна разрушать целлюлозу и обладает
фенолоксидазной активностью, что обеспечивает определенную лигнолитическую активность. Кроме
того, этот гриб способен расти при щелочном рН. Все это усугубляет трудности в борьбе с этой
плесенью, которая имеет очень близкие характеристики с Pleurotus ostereatus.
Селективность субстрата можно объяснить с точки зрения содержания легкодоступных сахаров.
Высокотемпературная обработка субстрата приводит к химическому гидролизу полисахаридов и
накоплению растворимых сахаров (табл.). Однако при пастеризации соломы при 65°С развивающиеся
в субстрате термофильные бактерии группы Bacillus утилизируют практические все растворимые
формы cахаров, не оставляя ничего для конкурентных мицелию плесеней (табл.). В процессе
ферментации происходит также подщелачивание субстрата и утилизация легкодоступных форм азота
(аммонийного). Для развития в субстрате плесени Trichoderma hamatum необходимо сочетание
нескольких факторов: слабокислый рН, повышенное содержание растворимых легкодоступных форм
азота и cахаров (табл.).
Таблица
Содержание растворимых сахаров в соломе после различной обработки.
Таблица
Влияние пастеризации на рН субстрата и содержание в нем растворимых сахаров и аммония.
Таблица
Рост Trichoderma hamatum на питательной среде (экстракт ферментированной соломы).
(данные таблицы не приведены в этой публикации)
Ферментация должна быть проведена таким образом, чтобы легкодоступные вещества полностью
были утилизированы бактериальной микрофлорой и остановлена в момент, пока еще не началось
разрушение основы субстрата - лигноцеллюлозного комплекса. Чрезмерное удлинение процесса
обработки субстрата ухудшает не только физические, но и питательные свойства субстрата.
Влияние термообработки на микроорганизмы субстрата.
Термическая обработка субстрата проводится с целью уничтожения конкурентных микроорганизмов,
а также вредителей (насекомые, клещи и т.п.).
Наиболее чувствительны к термическому воздействию психрофилы и мезофилы, наиболее устойчивы
- термофилы. В первую очередь, термическая обработка уничтожает вредителей и вегетативные
формы (мицелий) микроорганизмов. Споры микроорганизмов обладают повышенной
термостойкостью, особенно споры термофильных бактерий (табл.).
Мягкая термообработка (60 - 65°С) по сути, не является только пастеризацией, так как при этой
температуре могут свободно существовать и размножаться бактерии, относящиеся к облигатным
термофилам. На самом деле этот режим является режимом ферментации для облигатных термофилов.
...в субстрате развивается достаточное количество бактерий, которые полностью утилизируют
свободные сахара и создают высокий уровень селективности. Дополнительная ферментация
субстрата... способствует развитию группы термотолерантных термофильных бактерий, которые в
еще большей степени усиливают селективность субстрата и обеспечивают надежную
микробиологическую защиту от конкурентных плесневых грибов.
Умеренная термообработка (70 - 90°С) уже является пастеризацией, так как уничтожает все
вегетативные формы микроорганизмов и сохраняет часть споровых форм мезофилов и термофилов.
Умеренная термообработка сохраняет еще некоторый уровень селективности субстрата, так как
популяция термофилов достаточно быстро восстанавливается после обработки.
Жесткая термообработка (100 - 125°С) при достаточной экспозиции не только пастеризует субстрат
(уничтожение вегетативных форм), но и убивает споры микроорганизмов, в том числе и
термофильных бактерий. Такой субстрат становится стерильным и полностью теряет селективность.
На нем одинаково хорошо растет мицелий, и прекрасно развиваются конкурентные плесневые грибы.
Поэтому инокуляцию стерильного субстрата проводят в стерильных условиях и используют
стерильный, неперетаренный мицелий.
Таблица
Влияние термообработки на микрофлору субстрата.
Тип термообработки Режим, °С Споры бактерий Споры грибов Вегет.формы
Мягкая
60-65 + + +
Умеренная 70-90 + + -
Жесткая 100-125 - - -
+ сохраняются, - уничтожаются.
Влияние температуры обработки на селективность.
Термообработка субстрата вызывает ряд химических реакций, снижающих его селективность. Во-
первых, происходит термический гидролиз полисахаридов и высвобождение легкодоступных
сахаров, служащих хорошим питанием для конкурентов. Во-вторых, происходит делигнификация
лигноцеллюлозного комплекса субстрата. В результате, целлюлоза и гемицеллюлоза становятся
доступными для конкурентных плесневых грибов, типа триходермы, обладающих заметной
целлюлазной активностью. При высокотемпературной обработке лигноцеллюлозные связи частично
разрушаются и тем больше, чем сильнее обработка. Даже умеренная, но длительная термообработка
приводит к развитию на субстрате конкурентных плесеней. Различные способы обработки оказывают
как положительное, так и отрицательное воздействие на селективность субстрата (табл.).
Таблица
Влияние термообработки на селективность.
Тип обработки Температурный режим, °С Экспозиция, часы Селективность
Стерилизация жесткая 120- 130 1 -3 -
Стерилизация мягкая 100- 103 8-16 -
Пастеризация жесткая 90 - 100 1 -4
Пастеризация умеренная 70-80 8-12 +
Пастеризация -ферментация 60-65 24-48 + +
Ферментация 45-55 48-72 + + +
+ увеличение селективности
- уменьшение селективности среды.
Практическая часть.
Введение
Итак, после подробного рассмотрения всех теоретических вопросов, касающихся условий роста и
размножения грибов, а также свойств субстрата, наиболее благоприятствующих такому росту, мы
переходим непосредственно к технике культивации.
Но прежде небольшой исторический экскурс в историю искусственного размножения грибов.
Грибы в природе размножаются преимущественно спорами, однако они способны и к вегетативному
размножению с помощью кусочков грибной ткани. Эту особенность давно подметили грибоводы и до
конца прошлого столетия в качестве посадочного материала использовали дикорастущую грибницу.
Для выращивания шампиньона брали грибницу на навозной свалке, если же в неблагоприятные годы
на свалках грибница развивалась плохо, то ее размножали в специальных разведочных теплицах. Для
этого грибницу высаживали в подготовленные навозные грунты, но сверху землю не насыпали, с тем
чтобы не вызвать плодоношение. Когда субстрат почти полностью был пронизан разросшейся
грибницей, его вынимали и использовали как посадочный материал. Слегка подсушенный субстрат,
пронизанный грибницей, мог сохраняться годами. У нас таким методом получения мицелия
шампиньона пользовались уже в 30-е годы. Однако такая грибница не давала высоких урожаев,
быстро вырождалась, при посадке такого мицелия заносились и посторонние микроорганизмы,
тормозящие рост и ухудшающие плодоношение шампиньона. Поэтому ученые вели поиск новых
возможностей. В 1894 г. в Пастеровском институте во Франции была получена первая чистая
культура гриба, выращенная на специальной питательной среде из спор шампиньона. Грибница,
выращенная в стерильных условиях, имела значительно больший потенциал. Споровая грибница
быстро приживалась, активно росла на компосте, плодоношение ее наступало значительно раньше,
чем при использовании «дикого» мицелия. Поэтому уже с середины 20-х годов в большинстве стран
— производителей шампиньона работали лаборатории по производству мицелия. В Советском Союзе
способ получения стерильной грибницы был разработан в начале 30-х годов. Вначале грибницу
выращивали на простерилизованном компосте, одновременно велся поиск других питательных сред.
В 1932 году был запатентован способ выращивания мицелия на пшеничном зерне. Сейчас зерновой
мицелий использует большинство грибоводов мира. В современных грибоводческих комплексах для
культивирования грибов используют мицелий, выращенный на зерне пшеницы, ржи, ячменя, овса,
проса, кукурузы и других злаков. При выращивании вешенки и других грибов, растущих в природе на
древесине, посевной мицелий можно готовить как на зерне, так и на лузге подсолнечника,
виноградных выжимках, смеси опилок и т.д.
Интенсивная технология культивирования вешенки на лигноцеллюлозных субстратах начала
развиваться в Европе в 60-х годах. В 1965 году в Венгрии была разработана и в 1966 году
запатентована стерильная технология выращивания вешенки. Субстрат обрабатывали в автоклавах
при повышенном давлении и температуре 115-130°С. В качестве тары использовали 3-5 литровые
стеклянные банки. Стерильный способ давал прекрасные результаты, но был слишком
дорогостоящим.
Дальнейшее упрощение и удешевление технологии привело к замене автоклавирования обработкой
субстрата в аппаратах без давления при температуре 100°С. Этот вариант мягкой стерилизации или
атмосферной стерилизации был запатентован в 1970 г. Технология получила широкое
распространение благодаря простоте и экономичности.
Дальнейшее усовершенствование технологий приготовления субстрата было направлено на
повышение селективности и переход к нестерильному способу обработки. В 1970 г в Венгрии была
запатентована интегрированная микробиологическая технология, которая предусматривала обработку
субстрата термофильными бактериями. Культуру бактерий в большом количестве выращивали в
ферментерах. Субстрат сначала пастеризовали, а затем ферментировали.
В 1978 г была разработана ксеротермическая технология, которая была сначала реализована в
Венгрии, а затем в Италии. Сухой субстрат обрабатывали паром в течение 1-1,5 часов при
температуре 100 "С и затем увлажняли водой до необходимого уровня. Технология получила
широкое распространение, особенно в Венгрии.
Достаточно стабильные результаты дает гидротермическая обработка в простых металлических
контейнерах.
Некоторые грибоводы успешно реализуют стерильную технологию выращивания, получая на
небольших площадях высокие урожаи. Разработано несколько вариантов прессов для формирования
субстратных блоков, производительностью 1 блок/минуту.
Предварительная подготовка.
Заготовка сырья.
Составной частью большинства субстратов для выращивания вешенки и строфарии является солома
зерновых культур (пшеница, ячмень, рожь, овес, рис, просо и т.п.). Хорошие результаты получают на
стеблях, шелухе семян и лузге различных с/х культур (рапс, подсолнечник, гречиха и т.п.). В период
вегетации растения инфицируются различными микроорганизмами (первичная инфекция), в том
числе и конкурентными вешенке. Для предотвращения развития конкурентной микрофлоры
необходимо соблюдать ряд правил (на примере соломы):
1 ) Сырье должно быть свежее, сухое.
Солому лучше собирать сразу после обмолота зерновых. Заготавливать солому надо в сухую погоду.
Увлажненная солома - прекрасный субстрат для развития конкурентной микрофлоры.
2 ) Сырье должно быть чистое, однородное по составу.
Солома не должна содержать чужеродных примесей земли, сорняков, зеленых частей растений.
Солома хорошего качества имеет золотисто-желтый цвет, без признаков загнивания или плесневения.
3 ) Правильное хранение сырья.
Сырье должно храниться в условиях, предотвращающих его увлажнение.
Известно, что свежезаготовленная солома тормозит развитие мицелия в первые 3 месяца хранения.
Экологическая чистота сырья - необходимое условие для получения экологически чистой продукции
грибов. Мицелии грибов обладает свойством накапливать некоторые тяжелые металлы, особенно
цинк и кадмии. Отдельные виды сырья могут содержать повышенное количество этих элементов,
например, отходы типографии. Грибы, выращенные на субстрате, содержащем такие компоненты,
уже не будут экологически чистыми, а могут стать и опасными для здоровья человека. По некоторым
данным, применение пестицидов при выращивании пшеницы не оказывало никакого влияния на
качество и величину урожая вешенки. Тем не менее, при выборе места заготовки сырья учитывают не
только его экологическую чистоту (зараженность тяжелыми металлами, радионуклеидами), но и
интенсивность обработок растении пестицидами!
Складирование сырья
Измельчение
Солому зерновых и стебли различных с/х культур необходимо измельчать. Солому измельчают в
различного рода соломорезках, измельчителях грубых кормов, измельчителях растительного
материала, молотковых дробилках. Получают при этом различные фракции соломы 50 - 100 мм, 30 -
50 мм, 20 - 30 мм, 10-20 мм. Чем меньше фракция, тем плотнее и равномернее можно сформировать
блок субстрата и тем меньше усилий нужно на его формирование. Солома должна быть не только
нарезана на кусочки, но и расплющена, что достигается при использовании молотковых дробилок.
Обработанная таким образом солома лучше увлажняется, так как наружный восковой слои соломины
повреждается.
Неизмельченная или крупнонарезанная солома плохо уплотняется, из - за этого в мешках создаются
воздушные полости, где в период плодообразования формируются зачатки грибов и погибают, если
не разрезать пленку. Слабое уплотнение субстрата (менее 0,35 – О,40 кг/л) приводит к значительному
уменьшению объема блока после периода инкубации или 1-ой волны плодоношения. Пленка отстает
от субстрата по всему объему блока. В такой ситуации необходимо либо снимать пленку целиком,
либо делать новую формовку субстрата, обеспечивая хорошее натяжение пленки по блоку субстрата.
Таким образом, степень измельчения растительного материала влияет на плотность субстрата, на ход
плодоношения, качество грибов, а также выход урожая с одной емкости. Слишком мелкие частицы
(менее 3 мм) создают трудности с газообменом, так как при формировании блока возможно
переуплотнение. Для создания оптимальной структуры мелкую фракцию смешивают с крупными
частицами (10-30 мм). Во время измельчения образуется много пыли, состоящей из мельчайших
частиц субстрата и спор микроорганизмов. Для предотвращения распространения пыли помещение,
где приводят измельчение изолируют от внешней среды и от других помещений фермы.
Таблица
Различные способы увлажнения
Варианты Характеристика
Дождевание 2 –4 дня в плоской куче с периодическим ворошением
Замачивание в хол.воде 1-3 дня в ваннах (защелачивание воды известью ускоряет процесс)
Замачивание в гор.воде
1-4 часа в ваннах и смесителях
Смешивание
Если субстрат состоит из нескольких компонентов или применяют минеральные и питательные
добавки, то возникает необходимость в равномерном перемешивании. Минеральные и питательные
добавки подвергают такой же термической обработке, как субстрат. Если компоненты добавляют
после термической обработки субстрата, то их пастеризуют отдельно.
Компоненты, применяемые в небольшом количестве (минеральные, питательные добавки), удобно
вносить во время инокуляции вместе с мицелием, однако они должны быть предварительно
термически обработаны.
В технологической цепочке операция смешивания выглядит следующим образом:
1. Пастеризация соломы (Франция)
- соломенную сечку замачивают на 2-3 дня;
- после стекания воды солому смешивают с 10% гипса и 3% муки из птичьего пера. Тщательно
перемешивают в шнековом смесителе;
-пастеризуют субстрат при +60°С 24 часа в аэробных условиях.
2 . Ксеротермическая обработка соломы (Венгрия)
-соломенную сечку тщательно перемешивают с 10% сена бобовых трав в шнековом смесителе и
загружают в тоннель,
- обрабатывают паром сухой субстрат при 100°С -1,5 часа,
- увлажняют субстрат питьевой водой в шнековом смесителе, добавляя расчетное количество воды.
3 . Гидротермическая обработка (Россия)
- соломенную сечку загружают в контейнер,
- заливают водой с 0,5-1,0% извести,
- обрабатывают при температуре воды 60-70оС (2-12 часов),
- сливают воду, охлаждают и смешивают с посевным мицелием и питательными добавками
(обработанными
Увлажнение
Увлажнение субстрата должно обеспечивать необходимый запас влаги на весь период
культивирования (обычно 2-3 волны плодоношения). Для субстрата, упакованного в полиэтиленовую
пленку, с перфорацией, занимающей не более 5% всей поверхности, оптимальная влажность
составляет 65-70%. Водопоглощение различных видов растительного сырья существенно отличается.
Растительные субстраты, не имеющие воскового налета, легко смачиваются водой и быстро
увлажняются (опилки). Субстраты, имеющие восковой или жировой слой, медленно увлажняются и
требуют длительного замачивания в воде (хлопковые очесы, солома). Соломенную сечку увлажняют
на площадках, поливая и периодически перемешивая в течение 1 - 3 дней. Хлопковые очесы
проливают водой послойно во время загрузки в контейнер перед термообработкой. Ускорению
процесса увлажнения способствует повышение температуры воды и перемешивание субстрата. В
случае ксеротермической обработки, когда соломенную сечку в сухом состоянии обрабатывают
паром, последующее увлажнение водой происходит намного быстрее, так как пар удаляет часть
восковой оболочки и способствует набуханию соломины. Солому обычно смешивают с расчетным
количеством воды в шнековом смесителе. Процесс увлажнения занимает не более 30 минут. В
некоторых современных устройствах для увлажнения соломы используют вакуумирование. При этом
происходит удаление пузырьков воздуха из соломины и очень быстрое насыщение растительных
волокон водой. Процесс увлажнения сокращается до 10-15 минут. Влажность соломы достигает 75-
78%. Хорошему увлажнению соломы способствует щелочная среда.
Очень часто получение высокого урожая вешенки ограничивается недостатком воды в субстрате.
Каждый килограмм грибов выносит из субстрата 900 гр. воды (содержание воды в грибах около 90%)
и столько же теряется с транспирационным испарением с поверхности плодовых тел. При
понижении влажности субстрата менее 40% происходит торможение транспорта питательных
веществ из мицелия в плодовые тела. Субстратный блок в таком состоянии может образовать
зачатки плодовых тел, но их дальнейшее развитие будет невозможным. Субстрат, закрытый п/э
пленкой и полностью обросший мицелием очень трудно доувлажнять, поэтому при первоначальном
увлажнении необходимо максимально насытить субстрат водой, но так, чтобы не было
свободной воды. Участки субстрата, содержащие избыток свободной воды, заселяются либо
анаэробными бактериями, либо конкурентными плесенями. Блок при этом становится пятнистым или
полосатым в зависимости от распределения переувлажненных зон. Надо еще учитывать образование
биологической воды при дыхании (до 20% от сухой массы субстрата). В высоких, цилиндрических
мешках переувлажнение особенно проявляется в нижних зонах, где вода скапливается под действием
гравитационных сил.
Если работать на 1 волне плодоношения, то влажность субстрата можно формировать на уровне 65-
68%, если на 2-3 волнах - на уровне 70-72%, конечно, если это позволит влагоемкость субстрата. Во
всех случаях свободная вода (вытекает при сжатии субстрата в руке) должна быть на минимальном
уровне. Субстрат в п/э емкости должен сохранять небольшую остаточную влагоемкость, чтобы
впитать избыточную, свободную "биологическую воду". Самый простой способ проверки
достаточной влажности субстрата – это сжать сильно в руке субстрат. И если вода только проступит
между пальцами, то влажность в норме. Если вода совсем не выступит – она недостаточна. А если
побежит ручьем – то чрезмерна.
В принципе чем выше концентрация зндогенной влаги, тем лучше. НО излишек влаги приводит к
нарушению процессов аэрации и гибели мицелия. Оптимальная влажность практически всех
субстратов - 60-75%. Для некоторых видов грибов, растущих на деревянистых субстратах, влажность
субстрата должна быть меньше, как говорилось об этом ранее. Для стекания излишней влаги в дне
грибного блока делают 3-4 прокола диаметром 2-3 мм или отрезают углы пакета.
Пример измерения влажности при приготовлении зерна: Бланшированное зерно должно иметь вид
молочной спелости. Развариваемые зёрна не допускаются.
Влажность субстрата (%) определяют по формуле: Вес взятой порции зерна (г) минус вес этой же
порции после высушивания (г), умноженное на 100 и делённое на вес взятой порции (г).
Пример расчёта:
Взято 500 г бланшированного зерна, после высушивания до постоянного веса вес этой порции
уменьшился до 160 г. Влажность субстрата составляет - ((500-160)*100)/500=68%.
Промывка
Промывка субстрата используется для удаления загрязнений или ингибиторов роста мицелия.
Например, лузга подсолнечника часто содержит мелкие частицы обмолоченных зерновок. Без
промывки в лузговом субстрате во время заращивания сильно поднимается температура (более 30°С)
и, как следствие, развиваются различные конкурентные плесени (мукор, триходерма). Аналогичная
ситуация возникает на хлопковых очесах, которые содержат много пылевой фракции. Промывка
очесов от пыли позволяет выращивать вешенку на таком субстрате даже без термической обработки.
Свежесобранная солома содержит ингибиторы роста мицелия, которые разрушаются только
через З-4 месяца хранения. При замачивании соломы в воде ингибиторы вымываются, и урожай
грибов возрастает (табл.). Без замачивания на соломе чаще развивается антагонистичная грибам
микрофлора (конкурентные плесени). Это связано с тем, что при замачивании растворимые формы
сахаров переходят в раствор и удаляются с водой. Во Франции используют длительное
замачивание соломенной сечки в течение 60 часов в баках при полном погружении субстрата под
воду. После стекания воды солома имеет влажность 72-75%.
Температура внутри субстрата в период инкубации - один из важнейших факторов, которые
необходимо контролировать. При повышении температуры выше 30°С в субстрате бурно
развиваются конкурентные плесени и грибы (триходерма, мукор, навозники). При
замачивании субстрат теряет легкодоступные питательные вещества, он обедняется за счет
самой "опасной" питательной фракции. На замоченном субстрате повышение температуры в
первые дни инкубации (термогенез) выражено значительно слабее, особенно в больших блоках
массой более 15 кг.
В США, Франции, Италии применяют совмещенный вариант: увлажнение и промывка.
Измельченную солому увлажняют на площадках в течение 2-Зх суток и затем на сутки замачивают в
воде, полностью погружая солому под слой воды.
Таблица
Влияние замачивания соломы на урожай вешенки
(урожайность в % от сырой массы субстрата)
Обработка Солома свежая Солома 6-месячная
Увлажнение* 5,3 10,1
Увлажнение+замачивание** 15,8 15,5
* Полив соломы на площадке 2-3 дня
** Замачивание на 48-60 часов в воде
Термическая обработка
Способы обработки субстрата
Существует несколько основных способов термической обработки субстратов для выращивания
вешенки и кольцевика: стерилизация, пастеризация, гидротермическая обработка,
ксеротермическая обработка, ферментация.
Стерилизация может быть жесткой (давление пара 1-2 атмосферы и температура 120-130°С) и
мягкой (атмосферное давление и температура 100°С). При стерилизации уничтожаются все
микроорганизмы в вегетативной и даже споровой форме.
Менее жесткая обработка - это пастеризация. Классическая пастеризация это обработка паром
увлажненного субстрата. При пастеризации жизнедеятельность микроорганизмов
приостанавливается, но споры бактерий и некоторых грибов выживают. Пастеризация может быть
мягкой (60-65°С), умеренной (70-80°С) и жесткой (90-100°С).
Гидротермическая обработка - это вариант пастеризации, когда субстрат погружают в горячую
воду.
Ксеротермическая обработка - это термообработка паром сухого субстрата с дальнейшим
увлажнением чистой водой.
Ферментация - это самая мягкая термическая обработка, предназначенная для накопления полезной
термофильной микрофлоры, антагонистичной конкурентным плесеням.
Кроме термической обработки субстрат иногда подвергают воздействию жесткой радиации
(физическая обработка), химических препаратов (химическая обработка) или
микробиологических препаратов (микробиологическая обработка) (табл.).
Таблица
Способы обработки субстрата
Обработка Варианты Температура
(°С)
Экспозиция
(час)
Термическая жесткая 110-130 1-4
Стерилизация мягкая 100 8-16
Пастеризация
Ксеротермическая (сухая)
Гидротермическая (водная)
Пастеризация влажного субстрата
100
60-100
60-100
1-4
1-24
1-24
Ферментация Аэробная, анаэробная 45-55 24-48
Физическая Стерилизация радиационная - 0,1-0 5
Химическая Химические препараты - 1-24
Биологическая
Препараты термофильных организмов, дрожжи,
естественная микрофлора 25-50 24-120
В практике наибольшее распространение получили термические методы обработки субстрата и, в
частности, пастеризация. В некоторых случаях, когда однократная обработка не дает желаемых
результатов, применяют дробную термическую обработку (стерилизация или пастеризация) с
перерывом между обработками до 16-24 часов.
Влияние термообработки на химический состав и микрофлору субстратов.
Термообработка субстрата выполняет несколько задач:
- уничтожение конкурентных и паразитических микроорганизмов и вредителей;
- создание условий для колонизации субстрата мицелием;
- стимулирование развития полезной термофильной микрофлоры, повышение селективности
субстрата (при мягкой обработке);
- частичная термическая деструкция лигноцеллюлозного комплекса, облегчающая ферментативный
гидролиз субстрата мицелием.
В зависимости от уровня воздействия термообработки уничтожаются различные группы организмов
(рис.). В первую очередь, погибают нематоды, клещи, насекомые, затем вегетативные формы
микроорганизмов. Относительно термостойки вирусы и споровые формы грибов.
Рисунок (в данной публикации отсутствует)
Наибольшую термостойкость проявляют споры бактерий, которые выдерживают обработку при
100оС и погибают только при жесткой стерилизации паром под давлением при температуре 120-
130°С (табл.). Результат термической обработки зависит от времени воздействия высокой
температуры или экспозиции (табл.). Чем длительнее обработка, тем сильнее эффект.
Таблица
Влияние способов обработки на микрофлору субстрата
Обработка Темп.
режим
Эндоспоры
бактерий
Споры
грибов Вегетативные формы
Стерилизация жесткая 120-30° - - -
Стерилизация мягкая 100° + - -
Пастеризация 70-90° + +/- -
Пастеризация-
ферментация 60-65° + +/- + (накопление
термофилов)
Ферментация 45-55° + + + (накопление
термофилов)
+ выживают, - погибают, +/- выживают частично.
Таблица
Термическая устойчивость микроорганизмов
Группа Летально для 1000 000 клеток
Дрожжи, плесени бактерий (неспоровые) 80°С 10 мин
Спорообразующие бактерии 110°С 30 мин, 120°С 5 мин
Термостойкие спорообразующие бактерии 120°С 45 мин
Количество выживших микроорганизмов зависит как от экспозиции, так и от начального их уровня.
Чем выше инфицированность исходного сырья, тем больше вероятность выживания конкурентных
организмов после термообработки (рис.).
Для повышения эффективности термообработки применяют дробную стерилизацию или
пастеризацию. Первая обработка уничтожает все вегетативные формы и термочувствительные споры.
После обработки субстрат оставляют на сутки остывать. В этот период термостойкие споры начинают
прорастать, так как их прорастание стимулируется сильным термическим воздействием. Повторная
термическая обработка эффективно уничтожает проросшие споры. В случае дробной обработки
суммарную экспозицию субстрата при температуре несколько уменьшают.
Мягкая термообработка или ферментация при 45-55°С способствуют накоплению в увлажненном
субстрате полезной термофильной микрофлоры, большей частью бактерий рода Bacillus. При
благоприятных условиях за 24 часа количество бактерий увеличивается в 100-300 тысяч раз,
что обеспечивает высокий уровень селективности субстрата. Хорошие результаты дает
сочетание - пастеризация при 65-70оС (уничтожение конкурентной микрофлоры и вредителей)
и ферментации при 45-55°С (накопление полезной микрофлоры).
При термообработке, особенно жесткой, происходят сложные химические реакции, приводящие к
частичному гидролизу растительных полисахаридов (целлюлоза, гемицеллюлоза) и деструкции
лигнина. Эти изменения существенно повышают доступность лигноцеллюлозного комплекса не
только для мицелия вешенки, но и для конкурентных плесеней. Кроме того, в результате
термического гидролиза полисахаридов в субстрате накапливаются растворимые сахара,
легкодоступные для микрофлоры. Длительная жесткая термическая обработка при температуре
выше 100°С приводит к образованию циклических фенольных соединений, типа фурфурола,
которые токсичны для мицелия. Субстрат при этом коричневеет или «карамелизуется».
Рисунок
Зависимость между температурой и экспозицией, летальной для микроорганизмов.(в данной
публикации отсутствует)
Стерилизация
Стерильные технологии
Стерилизация - это самая жесткая термическая обработка субстрата, благодаря которой погибают
все микроорганизмы и, в том числе, их споры. Субстрат полностью освобождается от конкурентных
организмов, и развитие мицелия съедобных грибов проходит в наиболее благоприятных условиях. На
основе стерилизации разработаны стерильные технологии культивирования многих съедобных
грибов, преимущественно ксилотрофов, таких как вешенка, шиитаке, фламмулина, лаковый трутовик
и т.п. Стерильные технологии культивирования широко применяются в странах Юго-Восточной
Азии, где разработаны полностью автоматизированные "заводы" по выращиванию фламмулины,
гипсицигуса и других деликатесных ксилотрофных грибов. Используются и более простые схемы,
рассчитанные на ручной труд. Субстрат стерилизуют при повышенном давлении в автоклавах
(жесткая стерилизация) или при атмосферном давлении в металлических контейнерах (мягкая
стерилизация). Размеры субстратных блоков для стерильной технологии обычно небольшие, масса их
находится в пределах 1-4 кг. Инокуляцию субстрата проводят в стерильных условиях. Заращивание
или инкубацию субстрата ведут в нестерильных условиях в термостатируемых помещениях. При
этом емкости обеспечивают сохранение стерильных условий в субстрате. В период плодоношения
емкости открывают и проводят культивирование в таких же условиях, как при нестерильных
технологиях. По стерильной технологии можно выращивать все виды вешенки, но особенно
требовательны к условиям стерильности сорта и виды вешенки, чувстви- тельные к бактериальным
метаболитам, например, вешенка абалоне (Pleurotus cystidiosus).
Стерильные технологии достаточно дороги по затратам, но зато могут дать возможность работать на
очень богатых субстратах (содержание азота 2-4%) и получать урожай до 40-50% от сырой массы
субстрата. На площади в 100 кв.м. можно разместить все стерильное производство, которое будет
давать до 2 тонн грибов за цикл (2 месяца). Кроме того, стерильное производство можно достаточно
легко переориентировать на приготовление субстратного мицелия (на опилках, лузге или соломе).
Стерильная технология достаточно универсальна и позволяет выращивать многие виды съедобных
ксилотрофных грибов, в том числе и лечебных (шиитаке, лаковый трутовик и др.).
Основные характеристики процесса стерилизации даны в табл.
Таблица
Характеристика процесса стерилизации субстрата.
Параметры Стерилизация
жесткая мягкая
Давление 1-2 атм. Атмосферное
Температура 110-130°С 100°С
Время обработки 1-4 часа 8-16 часов
Термический гидролиз Выраженный, образуются растворимые сахара, происходит делигнификация
целлюлозы
Селективность
субстрата Полностью теряется
Микрофлора Погибают все организмы в вегетативной фазе и споры грибов и бактерий
Экзогенная защита Применение беномила неэффективно
Мицелий Стерильная фасовка
Емкость для субстрата Термостойкие пакеты, банки, бутыли с микропористыми фильтрами
Влажность субстрата Не более 70% (60-65%)
Условия инокуляции Стерильный бокс, ламинарный шкаф
Масса субстратного
блока 1-4 кг
Жесткая стерилизация
Жесткая стерилизация или стерилизация под давлением проводится в специальных устройствах -
автоклавах или стерилизаторах. Используют различные варианты электрических автоклавов,
например вертикальные (ВК-75), горизонтальные (ГК -100) или проходные (ГПД - 400, ГПД-560 и
т.п.). Паровые стерилизаторы работают от внешнего источника - пара парового котла или сетевого
пара. Наиболее удачный, с точки зрения защиты от инфицирования, вариант проходного автоклава
или стерилизатора. В этом случае загрузку емкостей с субстратом ведут с грязной подготовительной
зоны, а выгрузку производят в чистую зону. Чистая зона обычно держится под избыточным
давлением фильтрованного воздуха (фильтры грубой и тонкой очистки). Жесткая стерилизация
широко используется для производства посевного мицелия съедобных грибов. Общие принципы
стерильных работ практически одинаковы при подготовке стерильного субстрата для плодоношения
и зернового носителя для посевного мицелия. Отличие заключается в том, что для мицелия
используют более богатые среды (зерно злаков) и поэтому требования к стерильности
существенно выше. Выращивание вешенки и строфарий по стерильной технологии довольно
широко практикуется в странах Юго-Восточной Азии. Субстрат стерилизуют при культивировании
некоторых слабоконкурентных видов вешенки, например, вешенки "абалоне" Pleurotus cystidiosus.
Масса субстратных блоков невелика и составляет 1-3 кг (табл.).
Таблица
Культивирование вешенки "абалоне" Pleurotus cystidiosus.
Параметры Характеристика
Композиция субстрата Опилки лиственные-80г, очесы хлопка-20г, отруби риса-15г, мел-5г
Влажность субстрата 60-65%
Емкость для субстрата Полипропиленовые мешки с кольцом и ватной пробкой
Масса блока 1-3 кг
Режим стерилизации 1,1-1,5 атм. 1-2 часа
Инокуляция В стерильном боксе или ламинарном шкафу
Инкубация В чистом термостатируемом помещении
Плодоношение* В теплицах, на стеллажах при 4-30°С
*Пакеты открывают с одной или двух сторон или снимают совсем.
Рассмотрим основные этапы стерильной обработки:
1. Приготовление субстратной смеси (композиции)
Для древесных отходов (опилки, щепа, кора) стерилизация - самый подходящий метод обработки.
Используют преимущественно древесные опилки лиственных пород и некоторых хвойных (сосна,
кедр) в смеси с питательными (отруби, зерно, мука семян бобовых и т.п.) и минеральными (мел, гипс,
известь) добавками.
2. Увлажнение субстрата
После тщательного перемешивания компонентов субстрат увлажняют водой, но так чтобы не было
излишков свободной воды. При сжимании в руке вода не должна вытекать из субстрата. Так как
инкубация субстрата проходит в закрытой емкости и испарение воды минимально, то оптимальный
уровень влажности субстрата составляет 60-65%. Избыток воды очень часто приводит к развитию
бактериальной инфекции.
3. Фасовка
Увлажненный субстрат сразу фасуют в термостойкие емкости: банки или полипропиленовые пакеты.
Если увлажненную смесь оставить на длительное время (12-24 часа), то в субстрате начнется
развитие конкурентной микрофлоры, что может сильно осложнить затем процесс стерилизации.
Стеклянные банки (2-Зл) заполняют субстратом полностью до горлышка. Затем колышком делают в
субстрате канал диаметром 25-30 мм до дна банки. Плотность субстрата получается в пределах 0,4-
0,6. Банки закрывают термостойкими крышками (полипропиленовые, резиновые) с фильтром воздуха
(отверстия для воздухообмена). Полипропиленовые пакеты бывают двух типов: 1) с вклеенным
микропористым фильтром и 2) без фильтра. Пакеты заполняют субстратом на 2/3 объема. Субстрат не
уплотняют, а только придают блоку нужную форму. Самоуплотнение субстрата происходит во время
инкубации. Однако, если используют узкие цилиндрические мешки, то можно уплотнять субстрат
руками или механическим прессом. Верх пакета продевают через кольцо из термостойкого материала
(диаметр 30-50 мм) и закрывают ватной пробкой. У пакетов с фильтром верх мешка завертывают
несколько раз и для надежности закрепляют прищепкой.
4. Размещение емкостей
Емкости с субстратом располагают в стерилизаторе не вплотную, а на небольшом расстоянии друг от
друга ярусами на решетках так, чтобы воздух мог циркулировать между ними. Такое расположение
обеспечит равномерное распределение пара и нагрев субстрата и существенно снизит время
стерилизации. Если емкости уложить вплотную, то стерилизоваться будет не отдельная емкость
массой 1-Зкг, а вся партия субстрата массой 50-100 и более кг. Для разогрева такой массы нужно
намного больше времени. Емкости, находящиеся по краям, простерилизуются нормально, а
находящиеся в центре будут недостерилизованы. Придется значительно увеличивать время
стерилизации, а это может отрицательно сказаться на качестве субстрата.
5. Продувка
После загрузки автоклава самое важное значение приобретает характер перераспределения холодного
воздуха камеры при запуске в нее пара. Если нет хорошей продувки камеры, то оставшийся холодный
воздух может создать ложное впечатление избыточного давления пара. Поэтому очень хорошо иметь
температурный датчик в камере автоклава. При давлении 1,5 атмосферы температура в камере
должна достигнуть 121оС. Взаимосвязь температуры и давления подчиняется закону Бойля, но
только если воздух в камере нагрет равномерно. Датчики позволяют контролировать температуру и в
камере, и в субстрате. На самом деле отсчет времени начала стерилизации надо начинать, когда
разница в температуре воздуха и субстрата не будет превышать 10оС. Температура субстрата
достигает температуры воздуха камеры только через 1-2 часа! При увеличении массы блока
выравнивание температуры еще более замедляется. Таким образом, хорошая продувка перед
стерилизацией является важным и необходимым техническим приемом. Проведение стерилизации в
небольших объемах в скороварке, можно отсчитывать время с момента закипания. И после этого
можно закрыть крышку и начать отсчет времени.
6. Режим стерилизации
Для полной стерилизации твердых сред достаточно обрабатывать их при температуре 120 - 125оС и
давлении 1,5-2,0 атмосферы в течение 1-3 часов в зависимости от объема стерилизатора и массы
емкости субстрата. Чем больше стерилизатор и масса субстратного блока, тем продолжительнее
обработка. Время обработки приходится увеличивать также с увеличением питательности субстрата
или повышенной инфицированностью сырья. Минимальное время обработки 1 час (для маленьких
блоков), максимальное 3-4 часа. Более длительная обработка приводит к перестерилизации. В этом
случае опилки становятся темно-коричневыми, меняется их запах. Субстрат становится токсичным по
отношению к мицелию. Продолжительная стерилизация вызывает сложные химические реакции
превращения растительных терпенов в летучие масла и токсичные продукты типа фурфурола. Для
небольших объемов, помещаемых в скороварку, это время может достигать 45 минут от начала
закипания.
7. Охлаждение
Когда автоклав отключают, то давление и температура в камере начинают медленно снижаться. В
идеале при этом в камере должен образоваться вакуум. Если автоклав не держит вакуум, то при
остывании он засасывает холодный нестерильный наружный воздух, который надо фильтровать.
Автоклав, имеющий размах давления от +2 атм. до -2 атм. (вакуум) обеспечивает хорошее качество
стерилизации, так как при таком перепаде давления (4 атм.) биологические структуры более активно
разрушаются. Прежде чем открывают автоклав, выравнивают давление, впуская наружный воздух в
камеру через ватный фильтр. Помещение автоклавной должно быть чистым для предотвращения
инфицирования стерильных емкостей (когда нет проходного автоклава). В небольших объемах можно
оставить субстрат остывать в скороварке.
8. Выгрузка
Открывают люк стерилизатора. Субстрат в емкостях еще горячий. Если автоклав проходной, можно
подождать до момента, когда субстрат остынет и выгружать его в чистую зону. Если автоклав не
проходной и его выгрузка ведется в грязной зоне, то лучше выгрузить субстрат горячим и поместить
его для остывания в стерильный бокс под УФ-лампами. Помещение автоклавной должно быть по
возможности чистым. Субстрат иногда оставляют остывать в автоклаве (на ночь). В этом случае
воздух в автоклав должен поступать через ватный фильтр.
9. Инокуляция
Инокуляцию субстрата проводят в стерильном боксе с соблюдением правил стерильной работы.
Лица, работающие в стерильной зоне, не должны быть использованы перед этим на грязных работах.
При работе в боксе одевают стерильный белый халат, шапочку, марлевую маску. Ежедневно проводят
дезинфекцию рабочего стола в боксе и инструментов. Помещение бокса дезинфицируют перекисью
водорода (3-6% р-р) или гипохлоритом натрия (2-5% р-р), или облучением УФ-лампами. Контроль
чистоты воздуха в стерильной зоне проводят один раз в неделю, в нестерильной зоне - раз в месяц
(седиментация колонеобразующих частиц на питательной агаровой среде в чашках Петри).